磷酸化作用是生化反应中增加磷酸基并吸收能量重建高能键的过程。生物体依靠外界能量来维持生命，动物细胞通过内部呼吸利用储存于食物分子化学键中的位能。能量从分解代谢的放能反应到吸能反应，由高能化合物如三磷酸腺苷(ATP)调节。ATP水解时失去末端磷酸基，转化为二磷酸腺苷(ADP)，同时释放能量。如葡萄糖酵解时在第6位碳原子进行磷酸化，ATP为其提供磷酸基和能量，称为葡萄糖磷酸化作用。反之，从ADP合成ATP时，需要增加磷酸基，并提供能量。
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